导语


转录-翻译机器是细胞自复制的核心。细菌生长遵循简单的数学规律，这是否可以通过转录、翻译这些底层生化过程来解释？2021年7月发表于 PNAS 的论文“一个统一的基于自催化网络的细菌生长规律框架”构建了细菌的自催化网络框架，并推导说明，核糖体循环、RNA聚合酶循环等过程之间的耦合促进了细菌的均衡指数级增长。不过，通过简单的数学关系来描述细菌生理过程是“物理的”；而这背后各个生理机制之间的复杂关系则是“生物的”，理解生化过程与生长速率之间的因果关系并不容易，需要对细菌细胞内的自催化网络有更全局的理解。


研究领域：细菌生长规律、自催化循环、自复制、转录-翻译机器

刘桂 | 作者

梁金 | 审校

邓一雪 | 编辑



论文题目：

A unifying autocatalytic network-based framework for bacterial growth laws

论文链接：

https://www.pnas.org/content/118/33/e2107829118


研究发现，细菌生长的情况可以用简单的数学关系来描述，即细菌生长规律。这说明，细菌生长的核心可能存在着简单的基本原理。另一方面，细菌的细胞包含各式各样的自催化网络，以核糖体循环为例：核糖体能够翻译出组成核糖体的蛋白，而后者通过自组装形成新的核糖体。总体来说，这一过程中核糖体并没有被消耗，反而成为了自催化循环的核心催化剂。


在这篇文章中，作者构建了细菌生长的统一图景——细菌通用的自催化网络框架，并通过推导说明，自催化网络之间的关系如何促进单一细胞的均衡指数级增长。这其中的核心是转录-翻译机器，该机器包含了几个耦合的自催化循环：核糖体循环、RNA聚合酶循环、转运RNA装载循环（tRNA charging cycle）。基于该循环，作者推导循环对应的生长规律，并结合实验数据验证该规律，推测细菌的生长速率如何受温度、靶向药物等因素影响。


 



一、引入




1、细胞内的自催化循环


通用构造机是冯·诺依曼设计的一种机器，它能够通过获取指令、消耗材料建造包括自己在内的一些机器，因此是自复制的。细胞作为能够自复制的个体，它的转录-翻译机器可以作为冯·诺依曼通用构造机的一个体现，而这种机器也正是自复制单细胞生物的核心。


转录-翻译机器由RNA聚合酶以及核糖体这两个关键分子机器构成。根据中心法则，细胞中的所有蛋白质均由这套核心机器分两步合成：先是RNA聚合酶转录基因、形成“指令集”mRNA；然后核糖体通过翻译mRNA生成蛋白质。


要成为一个“通用构造机”，转录-翻译机器必须能够自我复制。转录-翻译机器的自复制是个复杂、但所有单细胞生物均俱备的过程。该自复制过程由两个重要的自催化循环所构成：RNA聚合酶自催化循环以及核糖体自催化循环。如果RNA聚合酶没有转录出核糖体RNA（rRNA），细胞就不能从头合成新的核糖体；同理，如果没有核糖体翻译出RNA聚合酶蛋白亚基对应的mRNA，RNA聚合酶的从头合成也就不能实现。因此，两个循环是耦合的，且都包括自组装的步骤。


RNA聚合酶和核糖体的自催化循环也都依赖于其他的自催化循环，这些循环也是转录-翻译机器的组成部分，它们负责tRNA与氨基酸的结合、协助核糖体翻译过程的启动、移位和终止等等。所有的自催化循环相互交织，彼此需要，移除其中任何一个循环的任意一个关键的催化剂都会破坏所有的自催化循环。


2、细菌生长规律


细菌生长规律（growth law）旨在研究在忽略细胞内因相互干扰的情况下，细菌生长所表现出的整体特征与某一组分之间简单的数学关系。例如：图1a表示了一组细菌生长速率λ与核糖体质量分数（纵轴，由于核糖体RNA占RNA约为85%，因此RNA/总蛋白比率与核糖体质量分数线性相关）之间的关系：当翻译工作正常时，生长速率与核糖体质量分数呈线性正相关（用实线表示）；当翻译受到抑制时，生长速率与核糖体的关系呈负相关（用虚线表示）；当完全抑制时，质量分数收敛于交点处，该点表示了翻译完全受限的情况下核糖体工作的分配情况。与图1a相似，图1b表示了不同情况下生长速率与非核糖体蛋白数量（图1c中粉色的部分）的线性关系。


图1. 一些细菌的生长规律[1]


核糖体中心论（ribo-centric）聚焦于“核糖体制造核糖体”的核糖体自催化循环，它的生长规律研究将细菌生长速率与核糖体蛋白质质量分数、核糖体翻译速率定量联系了起来。核糖体中心论也有其短板——忽视了中心法则中的转录部分，同时也忽视了细胞内其他的自催化循环。比如，当温度或转录发生微扰时，生长速率会明显改变；而以往的核糖体生长规律却认为，该扰动并不会使核糖体的质量分数发生改变。因此，需要更合适的模型去解释这一偏差。


在这个研究中，作者兼顾了转录与翻译，推导出基于转录-翻译机器的自催化的生长规律。此外，作者发现在所有细菌内，转录与翻译过程均耦合了其他的自催化循环，而不需要其他复杂的反馈。这种耦合锁定了所有循环，使所有组分保持相同的生长速率，细胞得以呈现均衡的指数增长状态（balanced exponential growth）。


图2. 细菌的自催化网络示意图


细菌的自催化网络如图2所示。左上角的图例展示了底物、产物以及催化剂构成的完整自催化体系，其中的图例元件含义如下：
  • 方框：自催化循环的反应描述
  • 实开放框：底物，被反应所消耗
  • 虚开放框（含箭头）：催化剂，催化反应但不会消耗

  • 箭头：反应产物，流向其他的循环或退出循环


图中的自催化网络一共展示了4组耦合的自催化循环，分别是：

  1. 转录-翻译循环：消耗原材料和能量，产出包括自身的所有蛋白质及副本，提供大部分循环的催化剂
  2. 代谢循环：将外源代谢物转化为核苷酸、氨基酸、脂肪酸等代谢产物，提供大部分循环的底物
  3. DNA复制循环：利用DNA作为模板复制其自身
  4. 膜合成循环：通过膜合成蛋白催化合成膜结构

 



二、结果：转录-翻译机器

利用多个耦合的自催化循环实现自复制




如图3所示，转录-翻译机器的自复制过程主要由三个耦合的自催化循环组成：核糖体循环、RNA聚合酶循环、tRNA装载循环，具体如下：

  1. 核糖体自催化循环：包含核糖体合成核糖体蛋白，RNA聚合酶合成rRNA两部分，然后核糖体蛋白与rRNA自组装形成新的核糖体
  2. RNA聚合酶循环：RNA聚合酶转录mRNA，翻译产生RNA聚合酶蛋白亚基，后者经过自组装形成新的RNA聚合酶
  3. tRNA装载循环：氨酰tRNA合成酶催化tRNA的氨基酸装载工作，而后tRNA运输的氨基酸参与到了核糖体的mRNA翻译过程之中，这其中就包括了氨酰tRNA合成酶的mRNA
  4. 任何全局未被消耗的底物均可视作催化剂，如mRNA之于蛋白合成反应

  5. 其余与翻译相关的循环不做讨论



图3.细菌的自催化网络示意图

1、核糖体自催化循环


从头合成核糖体，需要RNA聚合酶转录出mRNA以及rRNA，然后以mRNA为模版翻译成核糖体蛋白，游离一段时间后进入核糖体的组装线中，按照亚基的组装顺序依次嵌入核糖体中。假定rRNA是充足的，则推导核糖体蛋白的自催化循环，只需考虑核糖体用于合成核糖体蛋白的质量分数。

将上述的一系列步骤串联起来，作者通过推导耦合的常微分方程（核糖体蛋白丰度变化速率、活性组装态（active assembling state）的转化速率、整合新核糖体的速率、静态激活态相互转化速率），得出核糖体循环的生长规律。并进一步假设核糖体组装时间与核糖体在前体池中的游离时间远小于倍增时间，则有简化式：



在先前假设成立的情况下，该式等价于著名的细菌生长规律：，后者在实验中得到验证。则核糖体质量分数等价于核糖体分配系数，即分配用于翻译核糖体蛋白的核糖体质量分数。假设的有效性、核糖体分配系数与核糖体质量分数的等价性均得到了实验验证。然而，当前提假设失效（比如核糖体组装时间延长）时，质量分数与分配系数的偏差不能再忽视，而作者的模型也预测到了这个偏差，均可由实验所证实（见第三部分第2小节）。

由于核糖体是rRNA和核糖体蛋白自组装而成，与上述步骤相似，基于另一组常微分方程（RNA聚合酶亚基的丰度变化速率、激活为转录状态的速率、RNA聚合酶转录rRNA的速率、组装后的rRNA产出新核糖体的速率），作者推导出了基于rRNA的核糖体的生长规律，假设成立的情况下，该式等价于之前发现的rRNA自催化生长规律。


2、RNA聚合酶自催化循环


“RNA聚合酶生成RNA聚合酶”这样的自催化循环，其工作原理如下：具有活性的一部分RNA聚合酶被分配转录rpo（RNA聚合酶）基因，生成mRNA；同时，一部分活性核糖体被分配翻译这些mRNA、合成RNA聚合酶亚基。聚合酶亚基随后会自组装、形成新的RNA聚合酶。

RNA聚合酶生长规律由作者将耦合的常微分方程（rpo基因转录成为mRNA的变化速率、Rpo蛋白亚基变化速率、组装后的Rpo蛋白亚基上产出新RNA聚合酶的速率、活性RNA聚合酶分配给转录rpo基因的质量分数）联立而得，并采用了两组近期的实验数据以验证RNA聚合酶生长规律模型。

作者采用了两组近期的实验数据以验证该RNA聚合酶生长规律模型的效果：第一组实验中的研究者设计了一种大肠杆菌的可逆生长开关，该开关通过移除基因组中的RNA聚合酶亚基rpoBC的基因，构建在包含诱导性启动子以及荧光标记物的质粒之中。rpoBC基因的表达可由外源IPTG的浓度所诱导，IPTG浓度升高，可以观测较稳定的菌体生长速率；然而当IPTG浓度下降，则观测到生长速率有很明显的下降。

当IPTG浓度降低时，诱导表达减少，则聚合酶蛋白亚基RopB的游离池减少，新的RNA聚合酶组装时间将增加。结合组装过程中消耗速率、荧光衰减的速率以及RpoB供给的情况，修正后的组装时间可以用来表示生长速率（图4B）。生长规律在三组条件中均得到了较好的拟合效果（图4C）。

图4.RNA聚合酶的生长规律及实验数据拟合式


第二组实验中，研究者采用了在转录RNA起始过程中，靶向DNA与RNA聚合酶结合的药剂利福平（rifampicin）。研究者针对大肠杆菌采用了亚致死剂量的利福平，探究利福平浓度与生长速率、RNA-蛋白比率的关系。如图4D，可以看到生长速率随着利福平浓度的增加而降低。在核糖体生长规律中，RNA-蛋白比会随着生长速率的变动而改变，但实验中的RNA-蛋白比率仍然保持恒定。

作者通过RNA聚合酶生长规律来解释该差异。假设利福平的作用是减少活性RNA聚合酶的数量，则利福平浓度增加，活性RNA聚合酶质量分数减少，因此RNA聚合酶的生长速率降低了。此外，活性RNA聚合酶数量的减少会降低细胞中的转录活动，降低所有蛋白（核糖体或非核糖体）的mRNA水平。这就解释了为什么RNA-蛋白比率会保持恒定。


3、tRNA 自催化循环


在所有的自催化循环中，任何催化剂都是循环的一部分，并且可以视为构建自催化循环的核心催化剂。为证明这点，作者在图5展示了两条自催化循环中的生长规律：氨酰tRNA合成酶（aa-tRNA-synt.）生长规律、tRNA生长规律，具体如下：

  1. tRNA自催化循环：tRNA被RNA聚合酶转录，成熟的tRNA在热不稳定延伸因子（EF-Tu）的帮助下进入核糖体；一些被tRNA运送的氨基酸最终会形成新的RNA聚合酶，其中一部分聚合酶将对应tRNA的转录，完成整个循环，tRNA生长规律见图5A下

  2. 氨酰tRNA合成酶（aaS）循环：在氨酰tRNA合成酶催化作用下，tRNA与氨基酸相结合，而结合后的一部分tRNA参与了新氨酰tRNA合成酶的合成，完成整个循环，氨酰tRNA合成酶生长规律见图5B下



图5. tRNA与aaS自催化循环示意图

通过研究两个循环，作者发现了tRNA与RNA聚合酶的数量关系，即维持生长的状态下，生长速率μ与转录活RNA聚合酶的质量分数α、转录持续时间τ以及RNA聚合酶：tRNA比率有以下数量关系：


这里的数量指的是tRNA运送氨基酸进入核糖体这一过程所涉及到的分子数。尽管RNA聚合酶与tRNA并不直接相关，但RNA聚合酶产生的mRNA会经由tRNA完成翻译、tRNA运送的氨基酸会合成RNA聚合酶，因此这种数量关系在平衡增长的条件下是有意义的。

 



三、自催化生长规律的进一步应用




1、生长速率与温度的关系


37℃下，细菌的生长规律为（的变形），作者将通过回顾实验数据来讨论生长速率与温度的关系。作为嗜温细菌，大肠杆菌的适宜生长温度在20-40℃之间。这个区间内，细菌的RNA-蛋白比率不变，因此质量分数Φ也不会变化。但延伸速率γ受到温度影响，在温度变化时需要修正。修正后，细菌的生长速率与温度的数量关系呈指数式（温度以阿伦尼乌兹式的因子存在），这种关系更像是在描述一个化学反应。


图6. 生长速率与温度的关系

上述是正常温度下的情况，那在这个范围之外呢？高温下的蛋白变性，低温下的蛋白折叠错误，均会导致细菌生长状态异常，这时的细菌需要分配更多的核糖体，以弥补蛋白质的缺损。可以假设，在严紧反应（细菌处于不良的环境中引起氨基酸缺乏时，维持自身的响应机制）时，核糖体重新分配时会倾向于蛋白代谢的工作，因此在这些区间内需要对质量分数ΔΦ进行修正。数据预测结果显示（图6），大肠杆菌会在8℃（低温）以及49℃（高温）时停止生长，与实际数据相符。


2、抗菌药物对大肠杆菌生长的影响


拉莫三嗪（lamotrigine）是一种抗痉挛药物，近期研究表明拉莫三嗪会抑制核糖体的装配，从而起到抑菌的作用。实际上，拉莫三嗪是延长了核糖体的组装时间，通过核糖体生长规律与组装时间的关系，可以得出生长速率与拉莫三嗪浓度的关系。


在不忽略组装时间的假设下（第二部分第1小节提到的公式），求解核糖体生长规律式得到关于生长速率μ的二次方程，将μ的求解式泰勒展开，得：


展开式的前两项记为M1、M2，其中M1与组装时间无关，M2与组装时间线性相关。当远小于1时，组装时间带来的影响可以忽略不计；当趋近于1时，说明因为组装时间的增加，生长速率趋近于0。


根据实验数据对核糖体组装时间进行修正，得到了药物浓度与生长速率的关系式（图7上）。可以看出，极低浓度下的组装时间可忽略，生长速率受到的影响很小；受药物影响，组装时间延长，生长速率有了很明显的降低。

图7. 抗菌药物对生长速率的影响


FabI 蛋白在细菌细胞膜的脂肪酸合成过程中起到了重要的作用。靶向脂肪酸的生物合成（过程）的抗菌药物三氯生（triclosan），通过扰乱FabI蛋白达到抑菌的作用。要研究三氯生的影响，就需要将膜的合成与生长速率联系起来。


像大肠杆菌这样的圆柱状杆菌，新合成的膜是通过插入位点插入进去的。在均衡增长的情况下，由于转录-翻译机器的耦合性质，合成的蛋白预期会呈指数增长，因此在宽度不变的情况下，大肠杆菌延长菌体的速率也将是指数的。


通过推导相关丰度的增长规律，作者得到了膜合成与生长速率的数学关系：。根据实验数据对新膜嵌入速率进行拟合修正，得到药物三氯生的浓度与生长速率的关系式（图7下）。可以看出，受到三氯生的影响，脂肪酸供应不足导致新膜嵌入速率降低，生长速率随之受到影响。
 



四、讨论延伸




转录、翻译、新陈代谢、膜合成，细胞的诸多生化过程与细胞生长速率之间的联系，均可通过简单的数学关系——细菌生长规律来描述，但这并不等同于，理解生化过程与生长速率之间的因果关系是件易事。从自催化循环得到生长规律，需要局部层面上对循环内催化剂的时间尺度有所了解，也需要宏观层面上掌握各种催化剂的分配参数。要理解变量与生长速率之间的因果关系，就需要对分配系数的确定有全局的理解。而这就需要知道在各个自催化循环之间，细胞是如何分配、调控资源的，以及这些是如何在进化之中确定下来的。


退一步讲，较早发现的核糖体生长规律同样不能提供因果解释。当环境中的营养成分改变时，在几个耦合的自催化循环中，细胞是如何全局调控、改变核糖体质量分数、改变延伸速率的，这也需要合适的因果模型去解释。否则，我们难以分辨同一个生长速率背后不同的机制。


研究者通过发现这些交织在一起的生理过程中的催化剂，建立以催化剂为核心的自催化循环，并通过处于核心地位的生化过程——转录-翻译将其耦合起来，形成细菌细胞内统一的自催化网络。通过对生化过程的理解，对于该网络，研究者基于一些参数的省略与假设，发现了较多的生长规律。通过简单的关系式描述细菌生理过程，这是“物理的”；而这背后各个生理机制之间的复杂关系，又是“生物的”。通过一些参数的取舍，研究者在充满矛盾性的二者之间达成了微弱的平衡：一方面，这些生长规律简单而有效；另一方面，生长规律的有效性不能完全解释细胞的生理状态。


细胞如何响应内外环境变化？如何掌握诸多调整方案以应对进化的压力？我们该如何对生化过程与生长速率进行因果解释？理解和解决这些问题都是不小的挑战。



参考文献

[1]. Scott M, Hwa T. Bacterial growth laws and their applications. Curr Opin Biotechnol. 2011 Aug;22(4):559-65. doi: 10.1016/j.copbio.2011.04.014. Epub 2011 May 16. PMID: 21592775; PMCID: PMC3152618.



自生成结构读书会报名中


生命是有心（意识）的，但当你一层层剥开生命的组织，却只有心脏而没有一颗“心灵”；打开大脑皮层看到一个个神经元，却看不到“意识”。然而，生命与意识都具有”自我生成”的能力，生命自发从非生命中生成，意识自发从生命中生成。更惊人的是，生命与意识的自我生成结构似乎很相似。如果这个假设成立，那么最可能的备选结构会是什么呢？


为了更深入地认识复杂活系统的自生成结构，集智科学家小木球(仇玮祎)联合周理乾、王东、董达、刘宇、苑明理、傅渥成、章彦博等科学哲学、计算机科学、物理学和生物化学等学科的一线研究者共同发起组织《自生成结构系列读书会》。其中第一季《共识——自生成结构与自复制自动机的研究背景》，将自2021年11月20日开始，其后拟于每周五晚19:00-21:00线上举行，预计持续12周。欢迎从事相关研究、对相关领域有浓厚兴趣的探索者报名参与交流。



详情请见：
自生成结构读书会启动：剖解生命、意识与智能的核心结构



推荐阅读



点击“阅读原文”，追踪复杂科学顶刊论文