细胞如何获得秩序？除了形成细胞器，还可以发生相分离
导语
小小的细胞实际上是一个无比复杂的宇宙。DNA在细胞核中运筹帷幄，指导各种细胞器密切合作，产生功能各异的蛋白质。平均而言，一个细胞中有50亿个蛋白质分子在有条不紊地进行各项生命活动。那么，细胞是如何精确操纵不同反应，维持内部秩序呢？科学家发现，除了形成有膜的细胞器来区隔内容物，细胞内的蛋白质液滴会不停地融合、分裂和溶解，在疏水性和亲水性氨基酸的分子力作用下，改变折叠和保持形状的方式，进而从分子的集体行为中涌现出蛋白质凝聚物的功能——这个过程就是所谓的相分离。在基因表达、细胞分裂、血液凝结、许多神经退行性疾病的形成等过程中，相分离都发挥着关键作用，为我们思考细胞的底层工作机制提供了一种全新的视角。
研究领域：相分离，蛋白质凝聚，分子集体运动，涌现
Viviane Callier | 作者
王百臻 | 译者
梁金 | 审校
邓一雪 | 编辑
来源：David McLeod
“想象一下：把世界上所有人都挤进犹他州的大盐湖——我们所有人都肩并肩挤在一起，但同时每个人又以疯狂的速度从另一个人身边掠过。这个类比可以让你对一个细胞中50亿个蛋白质分子共存的密集程度有一些了解。”英国细胞生物学家、马克思·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所所长 Anthony Hyman 举例说。
在拥挤的细胞质中，为了保证细胞的生长、分裂和生存，酶需要准确地找到它们的底物，信号分子也需要同样精确地找到它们的受体。如果细胞仅仅只是一个装满了均匀细胞质的晃动袋，那这一切就很难做到，但事实并非如此。有膜的细胞器有助于组织内容物，有效区隔一系列物质，还能为重要的生命过程提供反应得以进行的生物膜表面。这类过程的例子有很多，比如细胞的生化燃料ATP的合成。但是，正如科学家们刚刚开始认识到的那样，细胞器只是细胞秩序的一个来源。
最近的实验表明，在分子力的作用下，一些蛋白质会自发地聚集成短暂的聚合物——凝聚物（condensate），这种分子力精确地平衡了细胞内液滴在形成与溶解之间的切换。凝聚物，有时也被称为无膜细胞器，可以在细胞中将特定的蛋白质与细胞内其余物质隔离开，以防止不必要生化反应的发生，并且，这种隔离能够很大程度地提高反应物的利用率。这些发现正在改变我们对细胞工作模式的底层认知。
举例而言，凝聚物可以解释许多不同细胞过程发生的速度。“凝聚物的关键在于，它不像是一个工厂；相比而言，它更像是快闪族（flash mob）。你打开收音机，所有人都聚在一起，当你把它关掉时，所有人都消失了，” Hyman 说。
“正因如此，这种机制是‘可以精心调节的’。”加州大学伯克利分校和劳伦斯·伯克利国家实验室的细胞生物学家 Gary Karpen 说，“仅仅需要通过改变分子浓度，就可以很容易地形成或溶解这些凝聚物。”这种难以置信的精度为细胞控制包括基因表达在内的许多生命现象提供了工具。
证明这种机制存在的首个线索出现于2008年夏天，Hyman 和他当时的博士后 Cliff Brangwynne（现任普林斯顿大学霍华德·休斯医学研究所研究员）正在大名鼎鼎的海洋生物实验室内教学，并研究秀丽隐杆线虫发育中的胚胎。当时，他们和学生观察到，受精卵中的RNA聚集形成可以分裂或彼此融合的液滴。Hyman和 Brangwynne 假设，这些“P颗粒”（P granule）是通过细胞质中的相分离（phase separation）形成的，就像油滴悬浮在醋汁当中一样。
这一提议发表在2009年的《科学》杂志上，在当时并没有引起太多的关注。但在2012年左右，更多关于细胞相分离的论文陆续发表，其中包括德克萨斯大学 Michael Rosen 实验室的一项关键实验，该实验表明，细胞信号蛋白也可以表现出这种相分离行为。到了2015年，相关研究的论文逐渐汇成一股洪流，从那时起，对生物分子凝聚物（这种液体状的细胞隔间既有弹性又有粘性）的研究变成了真正的热点问题。
现在，细胞生物学家似乎在他们所看到的任何地方都能够找到凝聚物：在基因表达的调控、有丝分裂中纺锤体的形成、核糖体的组装，以及在更多细胞核和细胞质内发生的细胞过程中。这些凝聚物并不只是一些新奇的现象，它们已然变得发人深省：凝聚物的功能从分子的集体行为当中涌现已成为凝聚物生物学的核心概念，这与认为生化制剂和它们的靶标像锁和钥匙一样相互匹配的经典图景形成了鲜明对比。
研究人员仍在研究如何探测这些涌现特征的功能；为了实现这一点，可能需要我们开发新的技术来测量和控制细胞中微小液滴的粘度和其他特性。
什么驱动蛋白质液滴的形成？
什么驱动蛋白质液滴的形成？
当生物学家第一次试图解释，什么驱动了活细胞中凝聚物背后存在的相分离现象时，蛋白质本身的结构为生物学家提供了一个自然的出发点。折叠良好的蛋白质通常包含亲水和疏水氨基酸的混合。疏水氨基酸倾向于隐藏在蛋白质褶皱中，远离水分子；亲水氨基酸则被吸引到表面。这些疏水性和亲水性氨基酸共同决定了蛋白质折叠和保持形状的方式。
但是在一些蛋白质链中，疏水氨基酸相对较少，所以它们难以折叠起来。相反，这些内在无序的蛋白质（IDPs）在形态上不断发生波动，并参与许多种弱的多价相互作用。多年来，IDP相互作用被认为是对类流体液滴行为的最佳解释。
然而在去年，Brangwynne发表了几篇论文，强调IDPs虽然很重要，但是“这个领域在强调IDPs的重要程度上已经走得太远了”。他说，大多数涉及凝聚物的蛋白质都有一个共同的结构域和一些无序区域。要形成凝聚物，分子必须与其他分子有许多弱的多价相互作用，而有另一种方法可以实现这一点：齐聚反应（oligomerization）。（注：齐聚物（oligomer）通常指分子量在10^4以下的低聚物，可凝聚形成高聚物。）
当蛋白质相互结合，利用重复的低聚物形成更大的复合物时，齐聚反应就会发生。随着蛋白质浓度增加，相分离和低聚物的形成也会增加。在12月举行的美国细胞生物学学会会议上，Brangwynne指出，随着低聚物浓度增加，它们相互作用的强度最终会克服成核壁垒（也就是创造一个表面将凝聚物与细胞质其余部分分离所需要的能量），在那时，蛋白质会把自己包含在一个液滴中。
在过去五年里，研究人员在理解蛋白质的这种集体行为如何由微小的物理和化学力产生这一方面取得了很大的进展，但他们仍在研究细胞如何（以及是否）利用这种现象进行生长和分裂。
凝聚物与基因表达
凝聚物与基因表达
凝聚物似乎涉及到了细胞生物学中的诸多方面，但其中受到特别关注的一个领域是基因表达和蛋白质合成。
核糖体是细胞中的蛋白质制造工厂，细胞中核糖体的数量往往限制了细胞的生长速度。Brangwynne与其他人的研究结果表明，快速生长的细胞可能会从细胞核中最大的凝聚物——核仁中得到一些帮助。核仁通过聚集所有必需的转录机制，包括制造核糖体RNA的特定酶（RNA聚合酶I），促进核糖体RNA的快速转录。
几年前，Brangwynne 和当时还在攻读博士后的 Stephanie Weber（现任蒙特利尔麦吉尔大学助理教授）研究了秀丽隐杆线虫早期胚胎中核仁的大小（以及相应的核糖体RNA合成的速度）是如何控制的。由于母虫为每个胚胎提供相同数量的蛋白质，所以较小胚胎的蛋白质浓度较高，大胚胎的蛋白质浓度较低。正如研究人员在2015年 Current Biology 中一篇论文中所报道的，核仁的大小与蛋白质浓度有关：小细胞有大核仁，大细胞有小核仁。
Brangwynne和Weber发现，通过人工改变细胞大小，可以提高或降低蛋白质浓度，以及由此产生的核仁的大小。事实上，如果把蛋白质浓度降低到临界阈值以下，就不会产生相分离和核仁。研究人员基于凝聚物形成的物理学推导出了一个数学模型，可以准确预测细胞中核仁的大小。
现在Weber正在寻找细菌中的凝聚物。细菌的细胞体更小，并且没有膜划分出的区隔。“也许这是一种更重要的区隔机制，因为它们（细菌）没有其他选择，”她说。
2020年夏天，Weber发表的一项研究表明：在生长缓慢的大肠杆菌细胞中，RNA聚合酶是均匀分布的；但在生长迅速的细胞中以液滴的形式聚集。快速生长的细胞可能需要将聚合酶集中在核糖体基因周围，以有效合成核糖体RNA。
Weber说：“看起来相分离在生命的所有领域都存在，它是一种普遍的机制，能够特异性地实现一大堆不同的功能。”
尽管Weber和Brangwynne指出，转录活跃地发生在核仁这一大型凝聚物中，细胞核中的其他凝聚物则有着相反的行为。细胞核中的大部分DNA被归类为异染色质，因为它们更紧凑，通常不会表达生成蛋白质。2017年，Karpen、Amy Strom（她现在是Brangwynne实验室的博士后）和他们的同事证明，一种特定的蛋白质会经历相分离，在果蝇胚胎的异染色质上形成液滴，这些液滴可以相互融合，可能提供了一种机制来压缩细胞核内的异染色质。
研究结果还为一个长期存在的谜团提供了一个令人兴奋的可能解释。几年前，遗传学家发现，如果把一个活跃表达的基因放在异染色质旁边，这个基因就会沉默，就好像异染色质状态在传播一样。“这种传播现象很早就出现了，但没有人真正理解它，”Karpen说。
后来，研究人员发现了一种参与表观遗传调控的酶，称为甲基转移酶，他们假设甲基转移酶会从一个组蛋白转移到下一个，沿着DNA链从异染色质到邻近的常染色质，一种“酶的加工机制”，Karpen 说。在过去20年里，这一直是解释这种扩散现象的主要模型。但Karpen认为，异染色质上的凝聚物就像绳子上凝结的水珠，可能是一种不同机制的产物，解释了沉默异染色质状态的扩散。“这是思考生物学如何工作的根本不同的方式，”他说。他现在正致力于验证这一假设。
ATP阻止蛋白质凝聚
ATP阻止蛋白质凝聚
凝聚物还有助于解开另一个细胞之谜，这个谜题并不是藏在细胞核内部，而是发生于细胞膜上。当配体与细胞表面的受体蛋白结合时，会引发一连串的分子变化和运动，在细胞质中传递信号。但要做到这一点，首先必须将机制中所有分散开来的参与者聚集在一起。Lindsay Case解释说，研究人员现在认为：相分离可能是细胞用来在膜受体上聚集所需信号分子的诡计。Lindsay Case在罗森实验室接受过博士后训练，本月她将在麻省理工学院开设自己的实验室。
Case指出，通常用于信号转导的蛋白质修饰（如磷酸化基团的添加），会改变蛋白质的价态。也就是说，这种修饰会改变它与其他分子之间相互作用的能力。因此，修饰也影响蛋白质形成凝聚物的倾向。“如果你想想细胞在做什么，它实际上是在调节这个化合价参数，”Case说。
凝聚物也可能在调节和组织小单体亚基聚合成蛋白丝方面发挥重要作用。Case说：“因为将分子聚集在一起的时间比在凝聚物之外的时间更长，这有利于聚合。”在她的博士后研究中，她发现凝聚物增强了肌动蛋白聚合成细丝的过程，帮助特殊肾细胞维持其不寻常的形状。
微管蛋白的聚合对帮助细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成至为关键。20世纪80年代，Hyman在剑桥大学分子生物学实验室进行研究生学习期间，对了解有丝分裂纺锤体的形成产生了兴趣。在那里，他研究了单细胞秀丽隐杆线虫胚胎在分裂成两个细胞之前是如何形成有丝分裂纺锤体的。现在他正在探索凝聚物在这个过程中所发挥的作用。
在一项体外实验中，Hyman和他的团队制造了微管结合tau蛋白的液滴，然后加入微管蛋白，微管蛋白会迁移到tau蛋白液滴中。当他们向液滴中加入核苷酸来模拟聚合反应时，微管蛋白单体组装成了漂亮的微管。Hyman和他的同事提出，相分离可能是细胞启动微管聚合反应和有丝分裂纺锤体形成的通用方法。
tau蛋白还能促使阿尔茨海默症的标志性蛋白聚集。事实上，许多神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症和帕金森病）都涉及细胞中蛋白质凝聚物的错误形成。
为了研究这些聚集物是如何形成的，Hyman的团队专注于一种名为FUS的蛋白质，这种蛋白质具有与ALS相关的突变形式。FUS蛋白通常会在细胞核中被发现，但在应激细胞中，该蛋白离开细胞核进入细胞质，并在那里形成液滴。Hyman的团队发现，在体外制造变异的FUS蛋白液滴时，大约8小时后，这些液滴凝固成“可怕的聚集物”。相较于正常形式的FUS蛋白，这种突变蛋白拥有快得多的液相到固相的转变速度。
也许问题并不在于，为什么疾病中这些蛋白会形成聚集物，而是为什么在健康细胞中这些蛋白不会聚集。“我在小组会议上经常问的一个问题是：为什么细胞不是炒鸡蛋？”Hyman在细胞生物学会议上说，细胞质中的蛋白质含量“非常浓缩，应该很容易从溶液中析出”。
Hyman 实验室的研究人员将细胞燃料ATP添加到纯化的应激颗粒（stress granule）蛋白凝聚物中，并看到这些凝聚物逐渐消失，这给他们提供了新的线索。为了进一步研究，研究人员将鸡蛋清放在试管中，在一根试管中加入ATP，在另一根试管中加入盐，然后加热它们。盐中的鸡蛋清逐渐聚集起来，但加入ATP的没有：在活细胞类似的浓度下，ATP阻止蛋白质聚集。
但这一切究竟是如何发生的？这曾一直是一个谜，直到Hyman在班加罗尔的一次研讨会上偶然遇到了一位化学家。这位化学家指出，在工业过程中，被称为水溶助长剂的添加剂被用来增加疏水分子的溶解度。回到实验室后，Hyman和同事们发现ATP作为水溶助长剂有很好的表现。
有趣的是，ATP在细胞中是一种非常丰富的代谢物，典型浓度为3～5毫摩尔。大多数使用ATP的酶都能在低三个数量级的浓度下有效工作。如果不需要ATP来驱动代谢反应，为什么ATP在细胞内的浓度如此之高呢?Hyman认为，一种可能的解释是，ATP在3～5毫摩尔以下并不起到水溶助长剂的作用。他说：“一种可能性是，在生命起源时，ATP可能进化成一种生物水溶助长剂，让生物分子在高浓度时仍然保持溶解状态，后来才用作能量来源。”
Hyman承认，这个假设很难通过实验来验证，因为在不影响ATP能量功能的情况下操纵ATP的亲水特性非常有挑战性。但如果这个想法是正确的，可能有助于解释为什么蛋白质聚集通常会在与衰老有关的疾病中形成，因为ATP的产生随着年龄增长会变得低效。
蛋白质凝聚帮助适应环境
蛋白质凝聚帮助适应环境
在神经退行性疾病中，蛋白质聚集显然是有害的。但是从液相到固相的转变在其他环境中可能具有适应性。
以原始卵母细胞为例，这些卵巢中的细胞在成熟为卵子之前可以休眠几十年。它们中的每一个都有一个巴尔比亚尼体（Balbiani body），这是在从蜘蛛到人类的各种生物的卵母细胞中发现的大型淀粉样蛋白凝聚物。科学家认为，在卵母细胞的休眠阶段，巴尔比亚尼体通过将大部分线粒体与长淀粉样蛋白纤维聚集在一起来保护线粒体。当卵母细胞开始发育成卵子时，淀粉样纤维溶解，巴尔比亚尼体消失。巴塞罗那基因组调控中心的细胞和发育生物学家 Elvan Böke 正在研究这些淀粉样纤维是如何聚集和溶解的，这可能会为治疗不孕症或神经退行性疾病提供新的策略。
蛋白质聚集也可以解决需要快速生理反应的问题，比如受伤后止血。例如，毛霉菌是一种真菌，有相互连接的根状菌丝网络，营养物质通过这些菌丝流动。由进化细胞生物学家 Greg Jedd 领导的 Temasek 生命科学实验室的研究人员最近发现，当他们损伤毛霉菌菌丝顶端时，最先是原生质涌出，但几乎立刻就形成了胶状堵塞物阻止出血。
Jedd 怀疑这种反应是由一种长链聚合物引导的，可能是一种具有重复结构的蛋白质。研究人员确定了两种候选蛋白质，并发现如果没有它们，受损的真菌就会灾难性地出血。他们研究了这两种蛋白质的结构，并称之为凝胶A和凝胶B。这些蛋白质有10个重复结构域，其中一些具有疏水氨基酸，可以与细胞膜结合。当原生质从损伤部位喷涌而出时，蛋白质也会在类似的力量作用下展开结构。Jedd说：“液体的流动具有巨大的加速度，我们认为这可能是一个触发器，告诉凝胶改变其状态。”这个堵塞的过程由一个物理因素触发，导致凝胶从液体不可逆地转变为固体。
相反，在脉孢霉属真菌中，菌丝被分成隔间，通过气孔调节水分和营养物质的流动。Jedd想知道气孔是如何打开和闭合的。他解释说：“我们发现一些紊乱的蛋白质，它们似乎在气孔处聚集，提供一种关闭气孔的机制。”
Jedd的团队了解到，候选的脉孢菌蛋白质具有重复的混合电荷结构域，在一些哺乳动物蛋白质中也可以找到。当研究人员合成不同组成、但长度和电荷模式具有相似混合的蛋白质，并将它们引入哺乳动物细胞时，他们发现这些蛋白质可以与细胞核斑（nuclear speckle）结合在一起，核斑是哺乳动物细胞核中的凝聚物，有助于调节基因表达。2020年，他们和华盛顿大学的 Rohit Pappu 研究组在 Molecular Cell 杂志的一篇论文中对此做了报告。
真菌和哺乳动物似乎独立发展了一套策略来利用蛋白质凝聚，“但他们是出于完全不同的原因，在细胞中的不同区域使用，”Jedd 说道。
对旧问题的新思考
对旧问题的新思考
相分离已经被证明是普遍存在的，对于这种现象与各种细胞功能如何息息相关，研究人员已经产生了很多想法。“（相分离）有很多令人兴奋的可能性，所以我认为这驱动了对该领域的兴趣，”Karpen说。但他也警告说，虽然在试管中显示分子经历相分离相对容易，但要在细胞中显示相分离的功能就困难得多。“我们还不知道那么多，”他说。
Brangwynne也同意这种看法，“老实说，整个领域基本上都还处于初始阶段。要理解这一切是如何运作的，还为时尚早。但我们才刚刚开始这一事实并不意味着液-液相分离不会是主要的驱动力。事实上，我认为它是。但它到底是如何工作的呢？”
这些不确定性也没有让Hyman气馁。“面对相分离，每个人能做的是，回头看看那些停滞不前的老问题，然后想：我们现在能不能用不同的方式来思考这个问题？所有的结构生物学研究都非常出色，但许多问题陷入了停滞，不能真正地解释现实。相分离所做的，就是让每个人去重新思考这些问题。”
参考文献
[1] Anthony Hyman et al. Germline P Granules Are Liquid Droplets That Localize by Controlled Dissolution/Condensation. Science Vol 324, 1729-1732 (2009). https://doi.org/10.1126/science.1172046
[2] Li, P., Banjade, S., Cheng, HC. et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336–340 (2012). https://doi.org/10.1038/nature10879
[3] Stephanie C. Weber, Clifford P. Brangwynne. Inverse Size Scaling of the Nucleolus by a Concentration-Dependent Phase Transition. Current Biology 25, 641-646 (2015). DOI:https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.01.012
[4] http://www.pnas.org/content/117/31/18540
[5] Strom, A., Emelyanov, A., Mir, M. et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature 547, 241–245 (2017). https://doi.org/10.1038/nature22989
[6] https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(15)00014-7
[7] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27471966/
[8] https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(20)30046-0
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